免疫荧光（Immunofluorescence， IF）染色是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断的技术。IF利用荧光标记抗体检测特异性靶抗原。染色成像非常直观，可以直接观察结果。虽然这是一个成熟的技术，但必须考虑多个因素，并采取各种优化步骤，以确保染色成功。

实验步骤：

培养细胞的免疫染色

除非另有说明，所有步骤均在室温下进行。为了获得最佳染色效果，除非使用的细胞系很脆弱（例如神经元细胞），否则应在缓慢移动的旋转摇床上进行操作。

一、固定和通透：

吸取培养基，用1X PBS（Cat No. PR20023）清洗接种在干净盖玻片上的细胞。

用新鲜的4%多聚甲醛在1X PBS中固定细胞15分钟。

用1X PBS冲洗盖玻片3次，每次3分钟。 

在1X PBS中用0.2%Triton X-100渗透5分钟。

用1X PBS冲洗盖玻片3次，每次3分钟。

二、封闭：

在1X PBS中制备5%正常血清的封闭溶液。从产生第二抗体的同一物种中选择血清，例如，如果第二抗体是山羊抗小鼠，则应选择山羊血清作为封闭液。

将细胞与封闭溶液孵育1小时（或者，如果没有相应的血清，则使用1X PBS中的3%BSA进行封闭。）

三、抗体孵育：

吸取封闭液，在抗体稀释缓冲液中稀释一抗。设置空白对照（在不加一抗的抗体稀释缓冲液中培养）。常温孵育1小时，或者，在4°C的温度下孵育过夜.

请注意：如果隔夜孵育，请采取措施确保盖玻片不会变干。

用1X PBST（Cat No. PR20024，含0.1%Tween）清洗样本3次，每次5分钟。

加入用抗体稀释缓冲液稀释的适量的荧光二抗，并在潮湿、黑暗的环境中室温孵育1小时。

请注意：加入荧光二抗后，实验样本必须尽可能保持在黑暗条件下。

用1X PBST（0.1%Tween）清洗样本3次，每次5分钟。

四、封片和镜检：

用含DAPI（如果需要）的封片剂将样本封固在载玻片上。

在荧光显微镜下检查载玻片。